Пцр гепатита с

Исследование для выявления возбудителя гепатита C (HCV), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) определяется наличие генетического материала (РНК) вируса и его количество (вирусная нагрузка) в образце крови.

РНК HCV может быть обнаружена в концентрации, находящейся за нижней границей линейного диапазона концентраций. Линейный диапазон концентраций – это диапазон, в котором можно точно посчитать количество копий возбудителя. Для данного анализа линейный диапазон концентраций ДНК HCV, определяемых детектирующим амплификатором, составляет 7,5×10² – 1,0×10⁸копий/мл образца.

Синонимы русские

Вирус гепатита С (ВГС), количественное определение РНК.

Синонимы английские

Hepatitis C Virus RNA, Quantitative, Real-Time PCR, Blood, HCV Viral Load, Hepatitis C Virus RNA Quant.

Метод исследования

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до сдачи крови.

Общая информация об исследовании

Вирус гепатита С (HCV) – РНК-содержащий вирус из семейства Flaviviridae, который поражает печень. Он способен размножаться в клетках крови (нейтрофилах, моноцитах и макрофагах, В-лимфоцитах) и вызывать криоглобулинемию, болезнь Шегрена и В-клеточные лимфопролиферативные заболевания. HCV благодаря высокой мутационной активности способен избегать воздействия защитных механизмов иммунной системы. Существует 6 генотипов и множество субтипов вируса, которые имеют разные значения для прогноза развития заболевания и эффективности противовирусной терапии.

Основной путь передачи инфекции – через кровь (препараты для переливания элементов крови и плазмы, донорские органы, нестерильные шприцы, иглы, инструменты для татуирования, пирсинга). Вероятно заражение при половом контакте и ребенка от матери во время родов, но это случается нечасто.

Острый вирусный гепатит, как правило, характеризуется бессимптомным течением и остается невыявленным в большинстве случаев. Только у 15 % инфицированных заболевание протекает остро – с тошнотой, ломотой в теле, отсутствием аппетита и потерей веса (редко сопровождается желтухой). У 60-85 % инфицированных развивается хроническая инфекция, что в 15 раз превышает частоту хронизации при гепатите В. Хронический вирусный гепатит С протекает с повышением печеночных ферментов и скудным проявлением симптомов. У 20-30 % больных заболевание приводит к циррозу печени, увеличивая риск развития печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциномы.

Выявление РНК HCV свидетельствует о размножении вируса в организме и является методом диагностики заболевания. Генетический материал вируса можно обнаружить с помощью ПЦР через 10-12 дней после инфицирования – в этот период специфические антитела, которые образуются через несколько месяцев после заражения, отсутствуют и биохимические показатели функции печени находятся в пределах референсных значений.

Посредством ПЦР выявляют РНК вируса качественно или количественно. Благодаря качественному методу подтверждается присутствие вируса гепатита С и его активное размножение. Количественное определение вирусной нагрузки с учетом генотипа HCV позволяет контролировать проводимую терапию и прогнозировать течение болезни.

Эффективность лечения оценивается по количеству РНК до и во время терапии. Обычно вирусная нагрузка крови снижается в несколько раз за первые три месяца успешного лечения. При эффективной терапии виремия уменьшается на два порядка в первые 4-12 недель лечения и после окончания курса терапии генетический материал вируса в крови не обнаруживается. Отсутствие снижения виремии через 12 недель с начала лечения указывает на его неэффективность. Рекомендовано проводить анализ до начала терапии, на 4-й, 12-й и 24-й неделях лечения и через 24 недели после окончания курса. Длительность терапии и периодичность количественного определения РНК вируса гепатита С зависит от генотипа вируса и степени повреждения печени.

Для чего используется исследование?

• Для подтверждения диагноза «вирусный гепатит С».
• Для прогнозирования течения вирусного гепатита С.
• Для мониторинга противовирусной терапии и решения вопроса о дальнейшей тактике лечения.

Когда назначается исследование?

• При качественном обнаружении РНК вируса гепатита С.
• При остром и хроническом вирусном гепатите С.
• При микст-гепатитах.
• При планировании, во время и после окончания противовирусной терапии.

Что означают результаты?

• Не обнаружено – РНК вируса гепатита С не обнаружена или значение ниже предела чувствительности метода (200 копий/мл = 400 МЕ/мл).
• < 7,5*10^2 копий/мл (<1.5*10^3 МЕ/мл) – РНК вируса гепатита С обнаружена в концентрации ниже линейного диапазона концентраций.
• < 2*10^6 копий/мл (< 4*10^6 МЕ/мл) – РНК вируса гепатита С обнаружена. Низкая виремия (наиболее благоприятный прогноз течения заболевания и эффективности терапии).
• > 2*10^6  копий/мл (>4*10^6 МЕ/мл) – РНК вируса гепатита С обнаружена. Высокая виремия.
• >1,0*10^8 копий/мл (>2*10^8 МЕ/мл) – РНК вируса гепатита С обнаружена в концентрации выше линейного диапазона концентраций.

Линейный диапазон концентраций РНК вируса гепатита С, определяемых детектирующим амплификатором, составляет 7,5*10^2 – 1,0*10^8 копий/мл (1,5*10^3 – 2*10^8 МЕ/мл).

Что может влиять на результат?

Недостоверный результат может быть получен при:

• загрязнении биоматериала;
• наличии в образце ингибиторов – химических и белковых субстанций, влияющих на различные компоненты ПЦР;
• присутствии в крови гепарина.

Важные замечания

• Уровень вирусной нагрузки крови не указывает на степень повреждения печени и тяжесть заболевания. Для их оценки необходимо исследовать биохимические показатели и материалы биопсии.
• При планировании лечения очень важно определить генотип вируса гепатита С.

Также рекомендуется

• Anti-HCV, антитела, ИФА
• Аnti-HCV, антитела
• Антитела к структурным и неструктурным белкам вируса гепатита
• HCV, РНК [реал-тайм ПЦР]
• HCV, генотипирование, РНК [реал-тайм ПЦР]
• Гамма-глютамилтранспептидаза (гамма-ГТ)
• Аланинаминотрансфераза (АЛТ)
• Аспартатаминотрансфераза (АСТ)
• Фосфатаза щелочная общая
• Альбумин в сыворотке
• Билирубин общий
• Холестерол общий
• Тромбиновое время
• Фибриноген
• Общий анализ крови (без лейкоцитарной формулы и СОЭ)
• Лейкоцитарная формула
• Скорость оседания эритроцитов (СОЭ)

Кто назначает исследование?

Инфекционист, гепатолог.

Литература

• Возианова Ж.И. Инфекционные и паразитарные болезни: В 3х т. — К.: Здоровье, 2000. – Т.1.: 600-690.
• Кишкун А.А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике. — М.:ООО МИА, 2006. – 471-476 с.
• Harrison’s Principles of Internal Medicine. 16^th ed. NY: McGraw-Hill; 2005: 1822-1855.

• Lerat H, Rumin S, Habersetzer F, and others. In vivo tropism of hepatitis C virus genomic sequences in hematopoietic cells: influence of viral load, viral genotype, and cell phenotype. Blood. 1998 May 15;91(10):3841-9.PMID:9573022.
• Revie D, Salahuddin SZ. Human cell types important for hepatitis C virus replication in vivo and in vitro: old assertions and current evidence. Virol J. 2011 Jul 11;8:346. doi: 10.1186/1743-422X-8-346. PMID:21745397.

www.helix.ru

Что показывает ПЦР анализ

Для диагностики гепатита С часто используется анализ ПЦР – полимеразная цепная реакция. Данный метод позволяет увеличить концентрацию в пробе (биологическом материале) некоторых фрагментов ДНК. Благодаря эффективности и высокой точности анализ широко применяется в медицинской практике – с его помощью диагностируются наследственные и инфекционные заболевания. Суть анализа крови методом полимеразной цепной реакции заключается в многократном копировании определенного фрагмента ДНК. Выбранный участок должен удовлетворять заданным требованиям.

ПЦР диагностика при гепатите С

Полимеразная цепная реакция помогает гепатологу поставить окончательный диагноз. С помощью метода можно определить, есть ли в исследуемом материале HBV. Качественный метод позволяет подтвердить факт заражения и установить патогенез заболевания. Количественный анализ ПЦР дает информацию о том, насколько интенсивно развивается гепатит С. На основании полученных в результате диагностики данных врач назначает пациенту наиболее эффективный курс терапии.

Для нахождения в крови ВГС сегодня применяются специальные тест-системы. Метод ПЦР назначается, если:

• результаты серологических исследований сомнительны;
• нужно определить генотип вирусного гепатита С;
• необходимо проконтролировать результативность противовирусного лечения.

Анализ осуществляется следующим образом: генетический материал (кровь) помещается в пробирку, к нему добавляются праймеры, ДНК-матрица, буферный раствор. Затем смесь нагревается до 95°С и охлаждается. После удаления из раствора остатков нуклеотидов специалист может определить, есть ли в исследуемом образце искомый ген. Если при диагностике методом ПЦР в крови пациента выявляется вирус гепатита С, врач определяет стадию заболевания и назначает курс лечения.

Анализ ПЦР РНК (качественный)

В результате качественного анализа может быть установлен только факт наличия вируса гепатита С в крови. Прохождение данного теста назначается всем, у кого выявлены антитела к ВГС. Результат исследования однозначен, возможны две формулировки: «обнаружено» и «не обнаружено». Первый вариант свидетельствует о том, что человек инфицирован, гепатит С прогрессирует и поражает новые клетки печени. Результат «не обнаружено» подтверждает отсутствие в крови ВГС. Наличие вируса в организме может быть выявлено качественным методом полимеразной цепной реакции только через одну-две недели после инфицирования.

Анализ ПЦР РНК (количественный)

Концентрацию вируса гепатита С (виремию) позволяет с высокой точностью установить количественный анализ ПЦР. Определив вирусную нагрузку (количество РНК), можно выбрать оптимальный способ лечения. Чем ниже уровень концентрации вируса, тем больше шансов на полное выздоровление. Количественный анализ используется не только во время начальной диагностики, но и в течение терапии. С его помощью можно контролировать успешность лечения и прогнозировать дальнейшее развитие болезни. Если прием медикаментов не приносит пользы, то количественное исследование укажет на отсутствие изменений. Такой результат должен стать основанием для внесения корректив в лечение.

Достоинства метода

Диагностический метод ПЦР имеет множество преимуществ, среди которых следует выделить чувствительность и точность. Анализ позволяет получить максимум информации о том, как ведет себя в организме больного РНК-вирус. Результаты исследования являются основой для подтверждения диагноза, если последний по какой-либо причине вызывает сомнения. Еще одно достоинство полимеразной цепной реакции заключается в возможности использовать для анализа различный биологический материал – не только кровь, но и мочу, слюну и другие выделения. Количественные и качественные исследования выполняются максимально быстро, что позволяет пациенту не томиться в ожидании результатов, а как можно раньше начать лечение.С помощью ПЦР можно определить, какова на данный момент активность вируса гепатита С и чем она угрожает больному. Если гепатолог назначил пациенту эффективную терапию, полимеразная цепная реакция покажет, что ВГС прекращает заражать новые клетки. Как правило, к такому результату приводит прием качественных медикаментов – например, индийских дженериков.

india-expres.com

Золотой стандарт диагностики гепатита

Метод ПЦР направлен на выявление РНК HСV в крови человека. Если генетический материал обнаружен, значит, имеет место виремия и активная репликация вируса гепатита в клетках печени. На ранней стадии метод ИФА (иммуноферментный анализ), когда определяются антитела, может не сработать, тогда необходима ПЦР.

После проведения анализа пациент получает на руки результат «РНК вируса гепатита С обнаружена» либо «РНК вируса гепатита С не обнаружена». Естественно, все надеются на хороший исход. Чужеродный генетический материал выявлен – значит, вирус активно размножается и захватывает всё новые гепатоциты.

Определение РНК вируса методом ПЦР идет в двух направлениях – количественном и качественном (вирусная нагрузка). При первом фиксируется количество единиц РНК в заданном объеме крови (стандартно это 1 мл) и выражается как «копии/мл». Качественный показатель отражает степень репликации вируса.

Даже незначительное количество инфекционных агентов указывает на наличие заболевания «гепатит С», то есть человек уже болен. Выявление концентрации вируса помогает определить, насколько высок риск передачи возбудителя и насколько эффективным будет лечение. Чем меньше количественный показатель, тем благоприятнее прогноз.

Генотипирование РНК вируса гепатита С

У вирусных агентов обычно есть разновидности, или штаммы. Так называют генетические вариации вируса. У HСV более 10 штаммов, однако в клинической практике фигурирует только 5: 1a, 1b, 2,3а/3b. Выявление конкретной разновидности РНК вируса именуется генотипированием. На основе полученных результатов подбирается лечение.

В крови и тканях одного пациента может присутствовать сразу 2 и более субтипов, к примеру 3a и 1b. Каждый из них имеет свои особенности. Хронизация HСV-инфекции происходит в 90% случаев, когда речь идет о генотипе 1b. В отношении 2 и 3а это число меньше – до 50%.

У людей, инфицированных субтипом 1b, наблюдается тяжелое развитие заболевания. Высок риск возникновения цирроза печени, гепатоцеллюлярной карциномы. У этой же категории больных сильно выражен уровень фиброза. Стеатоз, поражение желчевыводящих путей характерно для пациентов с генотипом вируса 3a.

Сдать анализ ПЦР на гепатит С можно в любое время в нашем медицинском центре. Мы предлагаем ускоренную диагностику с участием высококвалифицированных врачей-инфекционистов.

medcenter-sv.ru

Вариации анализа

Методика ПЦР стала доступна врачам несколько десятилетий назад. Она основана на множественном копировании определенного фрагмента вирусной или бактериальной РНК или ДНК, с последующей детекций (распознаванием данного фрагмента) в сыворотке крови пациента.

При этом существует два принципиально отличающихся метода ПЦР-исследования: количественный и качественный.

Качественный метод позволяет только ответить на вопрос: имеется ли в биологическом материале (сыворотка крови, слюна, семенная жидкость и т. д.) генетический материал определенного вируса?

Количественный метод, в свою очередь, позволяет определить количество этого генетического материала, что необходимо в ряде случаев для определения стадии заболевания или оценки эффективности терапии.

к оглавлению ↑

Качественный вариант ПЦР при заболевании

Использование качественного варианта ПЦР-анализа при данном заболевании позволяет обнаружить факт присутствия РНК вирусного гепатита С в биологических жидкостях (сыворотка крови, слюна и т. д.) больного. При этом результат анализа может быть только двух видов: положительный или отрицательный. Очень важна в этом случае его правильная расшифровка.

• положительный результат при определении РНК вирусного гепатита С говорит врачу о том, что в исследуемой биологической жидкости находится РНК данного вируса. Соответственно, пациент инфицирован им, а, значит, возможна постановка диагноза вирусного гепатита С. Однако всегда стоит помнить о возможности возникновения ложных положительных результатов анализа;
• отрицательный результат ПЦР-анализа свидетельствует об отсутствии РНК вируса гепатита С в исследуемой биологической жидкости, или же, содержание молекул РНК в исследуемой жидкости было слишком мало и располагалось ниже границы чувствительности ПЦР-метода. Отрицательный результат анализа не всегда может указывать на отсутствие вируса в крови. Возможность ложных отрицательных результатов анализа должна всегда учитываться лечащим врачом.

При развитии острой формы заболевания гепатита С проведение качественного ПЦР-исследования позволяет установить факт заболевания уже через 1-3 недели после попадания вируса в организм человека.

Ложные отрицательные результаты могут появиться в результате:

• попадания в биологический материал (кровь) загрязняющих субстанций;
• использование Гепарина для предотвращения свертывания крови в пробирке или его применение пациентом;
• попадание в исследуемый материал веществ из окружающей среды, блокирующих ферменты, используемые в ПЦР.

Пациент не должен соблюдать специальных рекомендаций перед проведением качественного метода ПЦР-диагностики. Для этого необходимо только взять кровь из вены пациента на анализ.

к оглавлению ↑

Количественный вариант ПЦР

Использование количественного анализа ПЦР позволяет определить не только сам факт присутствия вируса в крови, но и количество вирусных частиц в любой биологической жидкости (так называемую вирусную нагрузку). С помощью данной разновидности ПЦР можно определить число копий РНК вируса гепатита С, которые циркулируют в определенном объеме.

Результат данного типа ПЦР выражается в числовых значениях, где единицей измерения является международные единицы на миллилитр – МЕ/мл.

Проведение подобной разновидности ПЦР-диагностики используется в определенные сутки лечения вирусного гепатита С. Первое определение вирусной нагрузки происходит при поступлении больного человека в больницу. В дальнейшем анализ проводят на 1-ой, 4-ой, 12-ой и 24-ой неделях с начала применения лекарственных средств. Уже на 12-ой неделе можно сказать, эффективна терапия или нет.

Специально подготавливать пациента к проведению исследования не требуется. Рекомендуется не курить в день сдачи анализа. В качестве исследуемого материала используют кровь из вены.

После того как была проведена количественная ПЦР, необходимо произвести расшифровку полученных результатов. Понятия «норма» в подобных случаях не существует. Для расшифровки применяется специально разработанная градация показателей:

• результат исследования: не обнаружено – РНК вирусного гепатита С в венозной крови пациента не выявлена (результат отрицательный), или же она содержится в очень низком количестве, не позволяющем методу ее определить (<40 ME/мл – порог чувствительности количественного ПЦР);
• результат исследования: <8*10⁵ МE/мл – положительный результат теста. Такой уровень вирусной нагрузки очень низкий. Является показателем эффективности терапии и благополучного течения заболевания;
• результат исследования: >8*10⁵ МE/мл – положительный результат теста. Уровень нагрузки очень высокий. Плохой прогноз течения заболевания и необходимость коррекции или замены используемых лекарственных средств.

Важно запомнить, что полученный уровень вирусной нагрузки не отражает тяжесть течения патологии и степень разрушения печени. Для этого существуют другие методы биохимических исследований. Для правильного подбора методов лечения необходимо знать генотип вируса гепатита С.

Что же показывает вирусная нагрузка:

1. Высокий уровень концентрации вирусных частиц в биологических жидкостях, а особенно в крови, связан с высоким риском передачи вируса при половых контактах или во время беременности от матери плоду.
2. Количество вирусных частиц является отражением эффективности применяемых лекарственных средств и позволяет рационально выбирать препараты и используемые дозы.

к оглавлению ↑

Ультрачувствительный метод ПЦР диагностики

На сегодняшний день можно пройти так называемую ультра ПЦР на определение вируса гепатита С. Полностью этот метод называется ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным исследованием в режиме реального времени.

Когда показана ультра ПЦР:

1. В случаях подозрения на вирусный гепатит С у пациентов со скрытыми формами заболевания.
2. В случаях наличия у больного антител к вирусу гепатита С, но не подтвержденных ПЦР-диагностикой.
3. Для оценки эффективности проводимого лечения и подтверждения факта выздоровления.
4. В качестве скрининговой методики для раннего выявления заболевания у людей в популяции.

Для проведения исследования, как правило, используется венозная кровь пациента. Чувствительность ультра метода менее 10 МЕ/л, что в несколько раз выше, чем у стандартных количественных и качественных вариантов ПЦР-диагностики. Назначением ультра ПЦР занимается врач-инфекционист или врач-гепатолог.

Решающим этапом постановки диагноза и оценки лечения, является правильная расшифровка полученных результатов при ультра методе ПЦР. Всегда стоит помнить о том, что существует небольшая вероятность получения ложных отрицательных и ложных положительных результатов.

Для устранения подобных ситуаций, необходимо исключить загрязнение образцов крови и лабораторных материалов. С помощью применения ультра ПЦР возможно избежать ситуаций, которые приводят к ложным отрицательным результатам, и тем самым усложняют диагностику.

vsepropechen.ru

Стоимость пцр

ПЦР анализ, стоимость которого зависит от применяемых реактивов, и может составлять от 300 руб. до 5000 руб., выполняется от одних суток до недели.

Кроме метода ПЦР для выявления РНК ВГС также используется метод транскрипционной амплификации (ТМА), обладающий лучшей чувствительностью (порядка 5-10 МЕ/мл.), однако этот метод в России пока не распространен.

Как часто нужно делать ПЦР гепатита C? Обычно его проводят сразу после обнаружения антител к гепатиту C и после 4-й, 12-й, 24-й недели противовирусной терапии, а также через 24 недели после завершения ПВТ, а затем — ежегодно, в случае УВО.

Рис. 1. Пример результатов качественного ПЦР гепатита С.

Количественный анализ ПЦР (вирусная нагрузка) — это тест на концентрацию вируса (виремию) в  крови. Вирусная нагрузка — это количество единиц генетического материала (вирусной РНК), которая присутствует в определенном объеме крови (обычно это 1 мл, что соответствует 1 кубическому сантиметру). Это количество выражается в цифрах, единицы измерения МЕ/мл (международные единицы на миллилитр). Количество вируса может быть отображено по-разному. Например, 1,5 млн МЕ/мл, что соответствует 1.500.000 МЕ/мл или 1.5* 10⁶ МЕ/мл. В некоторых лабораториях используются другие единицы измерения — копии/мл. Коэффициент пересчета из копий в международные единицы различный для разных тест-систем. Примерно значения можно пересчитать по формуле 1 МЕ/мл = 4 копии/мл, например, 5.5* 10⁵ МЕ/мл = 2.2* 10⁶ копий/мл.

На что же влияет вирусная нагрузка?

Во-первых, на инфекционность. Чем выше концентрация вируса, тем выше риск передать вирус, например, при половых контактах или вертикальным путем. Во-вторых, концентрация вируса влияет на эффективность лечения (если лечение будет проводиться на основе интерферона). Так, низкая вирусная нагрузка является благоприятным фактором при проведении терапии, а очень высокая – неблагоприятным. Также, количественный ПЦР имеет большое значение при проведении интерфероновой терапии для оценки ее успешности и планировании длительности курса. Так, при быстром ответе на лечение и низкой виремии перед терапией, сроки лечения могут быть сокращены. И, наоборот, при медленном снижении концентрации вируса, ПВТ может быть продлена.

Какая нагрузка считается низкой, а какая — высокой?

Высокой принято считать нагрузку свыше 800 *10³ или 800.000 ME/мл, что примерно составляет 300*10⁴ или 3.000.000 копий /мл. Нагрузка свыше 1*10⁷ ME/мл считается очень высокой. Однако до сих пор среди специалистов нет общего мнения о значениях, разграничивающих высокую и низкую виремию. Так, в некоторых работах этой границей считается цифра 400.000 ME/мл.

Как часто нужно делать количественный тест?

Обычно его делают перед проведением терапии и после 12-й недели лечения для оценки ее эффективности в случае, если качественным тестом РНК еще определяется.

Результатом количественного теста может быть количественная оценка виремии в формате, описанном выше, а также результаты «ниже диапазона измерений» и «не обнаружено».

Порог чувствительности количественного ПЦР обычно выше, чем качественного. Так, для системы COBAS AMPLICOR он составляет 600 ME/мл. Результат «не обнаружено» может означать, что количественный тест и подтверждающий качественный тест не обнаружил вирусную РНК. Результат «ниже диапазона измерений» означает, что количественный тест не выявил РНК гепатита С, но вирус присутствует в очень малой концентрации (в случае, если при этом был проведен дополнительный подтверждающий качественный тест).

Рис.2 Пример результатов количественного теста.

www.hv-info.ru

Это тоже может быть вам интересно:

Заразна ли желтуха Симптомы гепатита у мужчин Гепатит в вакцинация Как можно заразиться гепатитом с в быту Ложноположительный анализ на гепатит с при беременности Как лечить гепатит с Признаки гепатита а